常见细胞器染色(3)——细胞核
01
细胞核的结构
细胞核的结构有核膜、核仁、染色质、核基质。主要功能是遗传物质DNA储存和复制的主要场所,是细胞遗传和代谢的控制中心。
1.核膜:双层膜,其上有核孔,是细胞核与细胞质之间的物质交换通道,表现出明显的选择性,RNA、蛋白质等大分子进出必须通过核孔。
2.核仁:在细胞有丝分裂过程中周期性消失(前期)和重现(末期)。
3.染色质:能被碱性染料染成深色的物质,主要由DNA和蛋白质组成。
4.核基质:是核中除染色质与核仁以外的成分,包括核液与核骨架两部分。
02
细胞核的功能
控制细胞的遗传,生长和发育。
细胞核是细胞的控制中心,一般说真核细胞失去细胞核后,很快就会死亡,但红细胞失去核后还能生活120天;植物筛管细胞,失去核后,能活好几年。
03
为什么要对细胞核染色?
从细胞核的结构可以看出,细胞核中最重要的结构是染色质,染色质的组成成分是蛋白质分子和DNA分子,而DNA分子又是主要遗传物质。当遗传物质向后代传递时,必须在核中进行复制。
细胞核又是细胞遗传性和细胞代谢活动的控制中心。遗传物质能经复制后传给子代,同时遗传物质还必须将其控制的生物性状特征表现出来,这些遗传物质绝大部分都存在于细胞核中。
04
如何选择对细胞核染色的染料?
1. 对死细胞染色的染料
PI是一种核酸荧光染料,可用于哺乳动物、细菌、酵母的染色。它不能透过完整的细胞膜,但能够透过死细胞和凋亡中晚期细胞的细胞膜而使细胞核染色。因此,PI 作为荧光探针常用于细胞凋亡(apoptosis)或细胞坏死(necrosis)的检测。进入细胞后,PI 与 DNA 和 RNA 结合,荧光强度增强 20-30 倍。在流式细胞分析中,PI 常与其他染料如Calcein-AM 、 Hoechst 33258 或 Hoechst 33342 联合使用,来区分凋亡早晚期细胞以及死细胞。此外,PI 也常作为多色荧光染色的复染剂使用。
Ethidium Homodimer-I (EthD-I) 是一种高亲和性的荧光核酸染料,与 DNA 或 RNA 结合后,可以使荧光增强 30 多倍,与 DNA 结合后发红色荧光(最大激发/发射波长分别为大约528/617nm)。常常用于哺乳动物、细菌、酵母和真菌的染色。(EthD-I)带有较强正电荷,所以该染料不能穿过细胞膜进行活细胞染色。但是 EthD-I 可以准确的检测溶液中的核酸或者解体细胞中的核酸,是一种较灵敏的核酸染色剂。
ethidium homodimer-1(红色)染色的结直肠癌Caco-2 3D细胞团
7-AAD是一种非渗透性的核酸荧光染料。该染料不能透过活细胞的细胞膜,但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜并与其内的DNA结合,可用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞,广泛用于流式细胞仪。7-AAD与DNA结合后可发出强烈的荧光,其荧光特性与PI相似,可被488nm氩离子激光激发,但其发射光谱较PI窄,且发射波长更长,对其他检测通道的干扰更小,在多色荧光分析中是PI的最佳替代品,可与多种488激发光激发的荧光染料联合使用,如FITC,PE等。
Oxazole yellow等同于YO-PRO-1 Iodide,是一种非细胞膜穿透性的高亲和力的羰花青单体核酸绿色荧光染料,在没有核酸的情况下基本上是非荧光的。该染料可用于鉴定凋亡细胞,Oxazole yellow可渗透进入早期凋亡细胞,对早期凋亡细胞进行染色,而碘化丙锭(PI, P4034)(一种死细胞染色)对早凋细胞保持非渗透性,但可染色晚凋细胞,这两种染料结合使用,可以区分早凋细胞和晚凋细胞。由此,本司推出了Oxazole yellow和PI联合的膜透性细胞凋亡检测试剂盒,用于区分早凋和晚凋细胞。以贴壁细胞(96孔板)举例,每孔100 μL染色工作液,配置为工作液(5 µM)大概可以用于2000个孔的染色。
DAPI 是一种可对DNA 染色的细胞核染色试剂,它在嵌入双链DNA后释放蓝色荧光。DAPI 常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。尽管DAPI 不能通过活细胞膜,但却能穿透扰乱的细胞膜而对核染色。DAPI 具有很高的光漂白承受水平,能用来检测酵母线粒体DNA,叶绿体 DNA,病毒DNA,microplasmDNA 以及染色体DNA。DAPI-DNA 复合物的激发和发射波长分别为 360 nm 和 460 nm。
DAPI将细胞核染为蓝色
2. 对活细胞染色的染料
Draq 5 是一种远红外荧光活细胞 DNA 染料,是一种对双链 DNA 具有高亲和力的蒽醌染料。它是一种可以透过细胞膜的染料,可标记活细胞或固定后/死细胞。在流式细胞术中,这种染料可用于区分有核和无核细胞。由于 Draq5能够按照化学计量比结合至 DNA,因此还可用于报告细胞核 DNA 含量,适用于染色体倍数和细胞周期分析。在荧光显微镜分析中,它可用作细胞核复染剂。Draq5 有很多应用,高度兼容现有仪器平台广泛使用的程序,主要的应用领域为 HCS,细胞模型,GFP,流式细胞仪和荧光显微镜。
Draq 5 将细胞核染为蓝色
Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光 染料,对细胞的毒性较低。Hoechst 33342 染色常用于细胞凋亡检测,染色后用荧光显微镜观察或流 式细胞仪检测。Hoechst 33342 也常用于普通的细胞核染色,或常规的 DNA 染色。Hoechst 33342 染色液可直接用于固定细胞或组织的细胞核染色,也可直接用于活细胞或组织的细胞核染色。
Ex/Em(结合DNA)= 346/460 nm
Ex/Em(未结合DNA)= 350/ 461nm
Hoechst 33258,也称bis Benzimide H 33258或HOE 33258,是一种非嵌入性的亮蓝色荧光染料。染料在溶液中荧光较弱,它们在活细胞中DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合后荧光变得明亮,故此类染料也被称为DNA探针。因背景较低,故染色细胞不需洗涤步骤,且染色非常稳定,对活细胞无毒,结合DNA染色后可持续几天或更长时间。Hoechst 33258与Hoechst 33342相比在水中的溶解度要高,但两种染料均具有高细胞膜渗透性,被广泛用于细胞凋亡检测,染色后可用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。
Ex/Em(结合DNA)= 352/461 nm
Ex/Em(未结合DNA)= 346/460 nm
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