SeeDB2 Trial Kit是用于SeeDB2法的透明化试剂盒，通过调整Permeabilization solution、Clearing Solution等各种试剂，可实现透明化。该方法由柯孟岑老师、今井猛博士等人开发，通过制备试剂盒内的溶液并浸泡脑组织块，即可实现透明化。特别适用于通过荧光蛋白标记样本的3D高分辨率成像。

该方法保留了脑组织的微结构，由于调节为高折射率（RI=1.52），适用于高分辨率成像，也可应用于迄今为止难以进行的树突棘定量分析。

对照SeeDB2G的甘油折射率（1.46）和SeeDB2S的油折射率（1.52），分别用甘油浸没镜头和油浸镜头观察，可见即使在深层部分也没有因为球面像差而引起模糊（分辨率降低）。

此外值得注意的是在SeeDB2中，荧光蛋白的荧光保持非常稳定，并且优于PBS和其他市售的封固剂。因此，SeeDB2十分适合作为荧光蛋白标记样本的封固剂。它不仅可用于厚样本，还可用于细胞生物学的薄样本和组织切片。

数据提供：国立研究開発法人理化学研究所柯孟岑先生、今井猛先生（现九州大学医学研究院）

本试剂盒内容：1）皂素、2）SeeDB2G solution、3）SeeDB2S solution、4）PBS

◆SeeDB2特点

● 可在保留微结构的同时完成透明化

● 调整为高折射率，可观察深层结构

● 稳定维持来自荧光蛋白的荧光^※

※Alexa等染料会出现褪色

◆经实例验证可透明化处理的样本

小鼠脑组织块、苍蝇全脑、类器官/球状体

◆SeeDB2 Trial Kit试剂盒构成

1. SeeDB2G Solution 50 mL x 1支

2. SeeDB2S Solution 50 mL x 1支

3. PBS（-）50 mL x 1支

4. Saponin 5 g x 1支

SeeDB2S：与油浸物镜浸液的折射率（1.52）相匹配，可用作油浸镜头观察时的封片剂。用于高分辨率成像。

SeeDB2G：与甘油浸物镜浸液的折射率（1.46）相匹配，可用作甘油浸镜头观察时的封片剂。用于观察较大的组织样本。

◆透明化所需试剂或器材（具体请参考附件）

试剂

1. SeeDB2 Trial Kit

2. 多聚甲醛（产品编号：160-16061）

3. 1×PBS（产品编号：164-25511）

4. 透镜浸液

器材

1. 环形镊子或画笔

2. 试管旋转器

3. 无菌过滤器

4. 振动切片机

5. 透明化样品观察容器（透明室）

6. 玻璃载玻片和盖玻片（如使用透明室则不需要）

7.  用于SeeDB2透明化样本的荧光显微镜^※和推荐物镜^※※

※ 共焦显微镜、双光子显微镜、超分辨率显微镜

※※ 请使用与折射率（RI=1.46或1.52）相匹配的物镜。建议在获取数据前向显微镜制造商咨询。

◆Protocol示例

小鼠脑0.5-2mm切片

● Permeabilization Solution：含2% saponin的PBS溶液

● Clearing Solution 1：含20％ saponin的水溶液和SeeDB2G以2:1比例混合的溶液

● Clearing Solution 2：含20% saponin的水溶液和SeeDB2G以1:1比例混合的溶液

● Clearing Solution３：含2% saponin的SeeDB2G

● Clearing Solution 4：含2% saponin的SeeDB2S

图1. 小鼠脑SeeDB透明化案例

小鼠脑切片（1.5mm厚）的SeeDB2处理前后

◆应用示例

● 共聚焦显微镜观察实例

● 超分辨率显微镜观察实例

● 神经细胞的多色荧光成像

使用共聚焦显微镜观察小鼠脑切片的实例

图2. 使用共聚焦显微镜观察Thy1-YFP H系小鼠脑切片

使用NA 1.4油浸物镜。即使不调整激光功率，从上到下得到的亮度也几乎恒定。比例尺为2 µm

超分辨率显微镜观察实例

在超分辨显微镜下观察使用SeeDB2S/Super Clear Mount（产品编号：190-18661）进行了透明化和封片处理的样品（图3、4）

图3. 丝状伪足在细胞膜上的生长

使用核染色试剂和线粒体染色试剂对在细胞膜上表达EGFP的HEK293T细胞进行染色和观察。通过超分辨率数据可观察到丝状伪足在细胞膜上的生长（图3）。

图4. 果蝇大脑深部的超分辨率成像（深度约100 μm）

使用GFP标记Mi1（果蝇脑髓质神经节中的一个神经细胞）并进行超分辨率观察（图4）。

神经细胞的多色荧光成像

图5. 使用Tetbow法进行神经细胞的多色荧光成像

使用Tetbow法^※ 标记小鼠嗅球二尖瓣细胞和簇状细胞的数据。比例尺为20 μm。

※ Tetbow法：使用不同颜色对单个神经细胞进行高亮度染色。

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