前言
近年来，随着再生医疗产品和生物制药的发展，对无菌检测快速化及可靠性提升的要求也日益提高。基于传统培养法的无菌检测从开始检测到结果判定通常需要14天，这不仅可能导致产品供应延迟，也给质量管理带来了诸多限制。 此外，药物无菌性不能仅依赖于最终检测结果，还应通过覆盖整个生产过程的无菌保障体系加以保证1）。在GMP和PIC/S中，无菌检测并非直接证明无菌性的手段，而是作为确认无菌保障体系有效性的补充措施1）。因此，除环境管理、设备适格性评价和工艺验证外，过程监控，即过程中检测的重要性也日益凸显。特别是快速微生物检测技术，有助于早期发现工艺异常，降低质量风险2）。此外，近年来，基于“质量源于设计”（Quality by Design，QbD）的理念，倡导从工艺设计阶段就把控并构建质量的方法3），并在此基础上，引入基于工艺数据保障产品质量的“实时放行检验”（Real-Time Release Testing，RTRT）概念4）。为实现上述目标，能够在生产过程中快速且高度可靠地检测微生物的技术不可或缺。
RiboNAT™ 快速无菌检测的特征 在基于核酸扩增法（NAT法）的快速无菌检测中，传统方法以基因组DNA（gDNA）为检测对象，而RiboNAT™快速无菌检测（RiboNAT™）的最大特点是采用了核糖体RNA（rRNA）作为检测对象。细菌以23S rRNA为靶标，真菌/霉菌则以28S rRNA为靶标。rRNA在活细胞中含量丰富，且与DNA相比，细胞死亡后会迅速降解，因此被认为是反映活菌存在的有效指标。基于这一特性，能够有效减少传统gDNA检测方法中因死菌残留gDNA引起的假阳性问题。 该方法如图1所示，包括以下几个步骤：①微生物活化及游离核酸的灭活；②利用酶和表面活性剂进行快速裂解并提取RNA；③通过一步法实时RT-PCR进行检测。通过该方法，传统需要14天完成的无菌检测可缩短至约7~18小时完成。采用该方法对《日本药典》第十八版（JP18）4.06《无菌试验法》规定的代表性试验菌进行检测时，也显示出较高的检测灵敏度，且已确认可检测低菌数（数CFU/mL水平）。此外，由于该方法不会与人细胞或培养基成分发生交叉反应，因此非常适用于再生医疗等产品的无菌检测。关于RiboNAT的性能数据，请参考我司相关产品的介绍页面，下文就gDNA污染的影响及大体积样品的检测方法作部分介绍。 图1. RiboNAT™ Assay Flow
图2. 微生物浓缩方法概述
使用RiboNAT™ 检测数十毫升样品的方法 在RiboNAT™ 标准检测方法中，无论是好氧菌还是厌氧菌，均使用1 mL以下的样本量。然而，对于部分客户来说，这一处理量可能无法满足其检测需求。和光纯药时报Vol.94 No.1（2026年1号）中发布的文章《【综述】再生医疗领域如何选择快速无菌检测法及相关问题》中也提到了样品中的微生物浓缩技术仍存在一定的挑战5）。本文将介绍利用离心和过滤进行微生物浓缩的方法及部分结果。在10 mL样品中分别各添加18 CFU的不同微生物后，按照图2的流程进行微生物浓缩，随后根据RiboNAT™ Assay Flow进行检测。 结果如表1所示，确认能够检测6种微生物。今后，我们计划进一步推进大体积样品的检测方法，包括采用过滤的方法，以及仅进行离心与去除上清液操作的方法。 孔内数值为Cq值，每个测试设置双孔检测 表1. 使用不同微生物浓缩方法检测的结果
关于RiboNAT™ 对gDNA混入的耐受性 为评估RiboNAT™ Assay Flow中混入gDNA时对假阳性抑制的效果，在裂解步骤中添加大肠杆菌来源的gDNA（每次提取中的添加量为30 ng），然后通过比较是否实施第1次DNase处理（1st DNase）和第2次DNase处理（2nd DNase），确认Cq值和核酸量的变化。 结果如图3所示，经DNase处理后，Cq值增加约16个循环（ΔCq≈16）。仅进行第1次DNase处理即可使gDNA减少99.992%；在第2次DNase处理后，也确认了同等水平的降低效果（表2）。因此，RiboNAT™ Assay Flow即使在混入纳克量级gDNA时，检测也不会受到明显影响，显示出较高的耐受性。 图3. 各检测条件中Cq值与未处理样品的差异
表2. 各检测条件下洗脱液中gDNA浓度及减少率
结语 本文介绍了RiboNAT™ 的性能以及大体积样品的检测方法。这些结果表明，RiboNAT™ 可适用于多种应用场景。 如前所述，关于无菌保证的理念，监管机构发布的相关文件中均有记载。另一方面，在Montag-Lessing,T等人发表的学术论文中也指出生产工艺中全程管控的重要性6）。因此，快速无菌检测方法不仅限于核酸扩增法，基于多种不同技术的实际应用也正在积极推进5）。 关于核酸扩增，美国药典（USP）正在推进针对有效期较短产品的核酸扩增法的相关文件，并以USP Chapter <75>的形式开展。FUJIFILM Wako也将继续支持各国相关文件的制定工作，致力于为客户提供更加便捷易用的检测方法。 RiboNAT™ 采用以rRNA为靶标的核酸扩增法，可实现对活菌的快速特异性检测。不仅可以作为传统成品放行检验的替代或补充方案，更有望应用于生产过程中检测，并成为支持“实时放行检验”等无菌保障策略的基础技术。
参考文献 Pharmaceutical Inspection Co-operation Scheme. PIC/S guide to good manufacturing practice for medicinal products : Annex 1 - Manufacture of sterile medicinal products. （2022）. Parenteral Drug Association. PDA technical report no. 33 : Evaluation, validation and implementation of alternative and rapid microbiological methods. （2014）. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q8 （R2）. （2009a）. International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q10 : Pharmaceutical quality system. （2009b）. 松山 晃文：和光純薬時報 Vol.94 No.1 （2026）. Montag-Lessing, T. et al. : Bundesgesundheitsblatt, Gesundheitsforschung, Gesundheitsschutz, 53, 45 （2010）.
相关产品 北京拜尔迪生物是FUJIFILM Wako授权代理商，更多产品，欢迎咨询订购！
热线：010-62960866
网址：www.biodee.net
北京拜尔迪生物（BioDee），成立于2003年，高新技术企业，专业从事生命科学方面的服务，为客户提供试剂、耗材、仪器及技术服务等一站式产品与服务，涵盖细胞生物学、微生物学、植物学、分子生物学、生物化学、免疫学等领域。
北京拜尔迪生物是多个进口品牌和优秀国产品牌的授权代理商，包括FUJIFILM Wako、Yakult、ThermoFisher OXOID、MP Biomedicals、INALCO、Ambeed、Abmole、百瑞极Biorigin、近岸蛋白novoprotein、模基Mogengel（ABW）、博奥森bioss、逸漠生物IMMOCELL、百迪科技、巴罗克Biologix、源叶生物、EFL（Engineering For Life）、lonsera、艾方生物、云克隆Cloud-Clone、海博生物、北纳生物、赛宁、倍沃Biomiga、南京建成、碧云天、武汉华美Cusabio、江莱生物、江苏晶美、阿拉丁、一品众合、欣友等品牌，同时经营NEB、Biolegend、abcam、santa curz、R&D Systems、Sigma、Millipore、SARTORIUS、ThermoFisher、Corning、Cytiva、Bio-Rad、Promega、Takara、QIAGEN、TOYOBO、megazyme、invent等品牌。
北京拜尔迪生物主营产品包括细胞培养基、基质胶、类器官、血清、细胞系、细胞染色试剂、细胞活力/凋亡检测试剂盒、缓冲液、重组蛋白及多肽、一抗、二抗、ELISA试剂盒、western blot系列、蛋白纯化、核酸提取、PCR试剂盒、植物/微生物干粉培养基、酵母筛选培养基、生化检测试剂盒、抑制剂、标准品、植物生长调节剂、抗生素、氨基酸等试剂和试剂盒，培养板/瓶/皿、细胞滤网、小室、冻存管、PCR管、离心管、移液管、吸头、加样槽、透析袋、滤器等实验耗材，以及仪器和技术服务等。
凭借专业的服务团队与充足的现货库存，北京拜尔迪生物已与国内多所高校、科研院所及医疗机构建立稳定合作，始终以“为科研工作者提供优质产品与服务”为宗旨，助力国内生命科学研究与世界前沿同步。
在线咨询
English