保存条件 

      常温10~25℃保存 12 个月蛋白酶 K -20℃保存。 

产品简介 

      本试剂盒可从≤20 mg 动物软组织(肝脏、脾脏、肾脏脑等) 、≤1×107 个培养细胞中快速提取 总 RNA。试剂盒基于硅胶柱纯化技术提取过程中无需使用 DTT 及 β-巯基乙醇整个提取过程可在 30 min 内完成。试剂盒结合 DNA 过滤技术可高效地过滤去除基因组 DNA提取的总 RNA 纯度 高无蛋白和其它杂质的污染可用于 RT-PCR、Northern Blot、Poly A 纯化、RNase 保护分析和 体外翻译等实验。

产品特点 

操作简便30 min 内完成数个样品的总 RNA 提取 

高效去除基因组 DNA独特的基因组 DNA 过滤柱无需 DNase 处理 

安全低毒无需 DTT 及β-巯基乙醇等有毒试剂 

RNA 纯度高提取的 RNA 无杂质残留适用于对纯度、完整性要求很高的下游实验。

适用范围 

       本品适用于动物软组织、细胞等样品的总 RNA 提取。

注意事项 

   1. 第一次使用前应在漂洗液 Buffer FRW1 中加入 48 mL 的无水乙醇

   2. 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌、汗 液及 RNase 等可能导致 RNA 降解 

   3. RNA 在裂解液 FRL 中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑 料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 h塑料器皿可在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 min然 后用水彻底清洗、灭菌 

   4. 配制溶液如 70%乙醇应使用 RNase-Free ddH2O将水加入干净的玻璃瓶中加 DEPC 至终浓 度为 0.1%(V/V)混匀放置过夜后高压灭菌。 

使用方法 

一、从动物组织中提取总 RNA 

   1. 每 10~20 mg 组织加 350 µL Buffer FRL用电动匀浆器将组织彻底匀浆, 然后加入 10 µL  Proteinase K混匀后室温放置 5 min 

注意脾脏组织建议使用 5 mg肌肉类的组织可以增加到 50~100 mg。 

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2~5 min取上清按第 3 步进行操作 

二、从培养细胞中提取总 RNA 

       本产品单次可处理 102~107 个细胞。初次使用时建议使用 2~5×106 个细胞。根据结果再调整 细胞量。但不论何种情况细胞量不要超过 1×107。 

   1. 加入适量的 Buffer FRL 至细胞样品中打散细胞 

   1) 悬浮细胞离心收集的细胞弹打或涡旋松散细胞沉淀加入适量 Buffer FRL 和 10 µL Proteinase K涡旋或用移液枪吸打打散细胞。

   2) 贴壁细胞可直接在培养容器中裂解容器直径不超过 10 cm或者使用胰蛋白酶处理后离心 收集细胞沉淀。

    a. 直接裂解法彻底吸弃培养液向培养瓶或培养皿中加入适量的 Buffer FRL 和 10  µL Proteinase K。

    b. 胰蛋白酶处理法彻底吸弃培养液用 PBS 洗涤细胞吸除 PBS加入含有 0.10%~0.25% 胰 蛋白酶的 PBS 处理细胞当细胞脱离容器壁时加入含有血清的培养基失活胰蛋白酶将细胞溶 液转移至 RNase-Free 的离心管中300×g 离心 5 min收集细胞沉淀仔细吸除所有上清加 入适量的 Buffer FRL 和 10 µL Proteinase K。

   2. 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2~5 min取上清按第 3 步进行操作 

注意样品量过多裂解不充分会导致裂解液粘稠堵塞 gDNA 过滤柱如果裂解液非常粘稠可适当增加 裂解液用量。

   3. 把 RNase-Free gDNA Remove Column 放在 2 mL 收集管中把细胞裂解液或组织上清液转 移至 gDNA 过滤柱中12,000 rpm (~13,400×g) 离心 30 s保留滤液

注意组织裂解液需高速离心去除杂质细胞碎片会引起柱子的堵塞。处理某些样品时离心后裂解液表 面还可能会有一层脂类层转移上清液尽量不要吸到这些物质。若 gDNA 过滤柱堵塞可将滤液吸出加 入适量裂解液匀浆后再转移至新的 gDNA 过滤柱中。

   4. 丢弃 gDNA 过滤柱滤液中加入等倍体积 70%乙醇用移液枪吸打 3~5 次 

   5. 把 RNase-FreeRNA Column 放在 2 mL 收集管中将溶液和沉淀一起转移至吸附柱中。 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 30 s倒掉收集管中的废液把吸附柱放回收集管中 

   6. 如不进行 DNase I 消化加入 700 µL Buffer FRW 至吸附柱上12,000 rpm (~13,400×g) 离 心 30 s倒掉收集管中的废液把吸附柱放回收集管中 

   7. 可选若后续实验对 RNA 纯度比较严格可选择使用 DNase I需另外订购进行膜上 DNase 消化 

    1) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)离心 30 s弃废 液将吸附柱放回收集管中

    2) 向吸附柱中央加入 DNase I 工作液室温放置 15 min 

    3) 向 RNase-Free 吸附柱中加入 350 μL Buffer FRW12,000 rpm (~13,400×g)离心 30 s弃废 液将吸附柱放回收集管中 

    8. 加入 500 µL Buffer FRW1使用前请先检查是否加入乙醇至吸附柱中室温静置 2 min12,000  rpm (~13,400×g) 离心 30 s倒掉废液把吸附柱放回收集管中 

    9. 重复步骤 8 

  10. 12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2 min倒掉废液将吸附柱置于室温放置数分钟以彻底晾干 吸附材料中残留的漂洗液 

注意此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除漂洗液的残留可能会影响后续的 RT 等实验。 

  11. 将吸附柱转移至新的 RNase-Free 离心管中向吸附膜的中间部位悬空滴加 30~100 μL RNaseFree ddH2O室温静置 2 min12,000 rpm (~13,400×g) 离心 2 min得到 RNA 溶液将洗 脱的 RNA 溶液置于-80℃保存。

注意洗脱缓冲液体积不应少于 30 μL体积过小影响回收效率。 

常见问题与解决办法 

 Q1柱子出现堵塞 

 A1

     1) 样品过量。裂解液粘稠减少样品量或加大裂解液用量样品量过多反而会降低产量和纯度 

     2) 裂解液离心不充分。组织裂解液需高速离心去除杂质杂质会引起柱子的堵塞转移上清液尽量 不要吸到杂质 

     3) 离心温度过低。本产品使用操作均在室温下进行。

 Q2RNA 提取过程中 gDNA 过滤柱堵塞

 A2 

     1) 增加离心次数、时间或转数 

     2) 可将滤液吸出加入适量裂解液匀浆后再转移至新的 gDNA 过滤柱中。