产品描述:偶联 anti-HA tag 纳米抗体的琼脂糖珠用于免疫沉淀 HA tag（YPYDVPDYA）的融合蛋白。

产品优势 

 没有普通抗体的轻链和重链；

 高亲和力：解离常数达到 nM-pM 级别； 

 高载量：20ul 的 beads 悬液可以结合 2-5ug HA tag 的融合蛋白； 

 较短的孵育时间，结合 30-120 min 即可；

应用范围  

     可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色质免疫沉淀（ChIP）/RNA 结合蛋白免疫沉淀（RIP）、 酶活性测定、质谱分析等； 

特异性  

     可以结合 HA tag 的融合蛋白。 

产品特性 

     存储缓冲液：PBS(含有 20%乙醇)。 保存条件：可在 4℃保存至少 1 个月，在-20 度或-80℃保存 1 年，避免高速离心，干燥和反复冻融。 

实验原理

实验步骤：  

收集细胞：  

     每个免疫沉淀反应大约使用 106-107 的哺乳动物细胞（约一个 10 厘米培养皿）表达绿色荧光蛋白融合蛋白。吸出生长培养基、向培养皿中加入 2 毫升预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，利用细胞刮或胰酶消化的方法收集贴壁细胞，细胞转移到离心 管，500 g 离心 3-5 分钟并丢弃上清液。 

细胞裂解： 

     1．用 500 ul 预冷的裂解缓冲液重悬细胞，在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂（自备）。对于膜蛋白或核/染色质蛋白，可使用 RIPA 裂解液（货号：BN25012）中加入蛋白酶抑制剂（货号：BN25002）。

     2．把离心管放置在冰上 30 分钟，可以每 10 分钟充分吹打一次。 

     3．细胞裂解产物在 4℃，20,000 g 条件下离心 15 分钟，转移裂解产物到一个新的预冷管中，丢弃沉淀。注意：此时细胞 裂解产物可以放在-80℃进行长期储存。

平衡珠子： 

     4．振荡混匀 HA tag-Nanobody-Agarose Beads，吸取 20ul beads 悬液到 500 ul 预冷的裂解缓冲液中，在 4 ℃，2,500 g 条件下离心 3 分钟，丢弃上清液。（此步骤可选） 结合蛋白  

     5. 将细胞裂解产物加入到平衡的 HA tag-Nanobody-Agarose Beads 中（如果未做第 4 步，可在细胞裂解产物中直接加入 20ul beads 悬液），在 4 ℃冷柜中的旋转混合仪上结合 30-120 min。如果需要，保存 50 ul 的裂解产物进行免疫印迹分析。 

     6. 在 4 ℃，2,500 g 条件下离心 3 分钟，丢弃上清液。

清洗珠子：  

     7. 用 500 ul 预冷的裂解缓冲液中洗涤 HA tag-Nanobody-Agarose Beads，在 4 ℃，2,500 g 条件下离心 3 分钟，丢弃上清液并重复洗涤 2 次。（可选：在第二次洗涤的步骤中增加盐浓度到 500 mM）。 

洗脱蛋白： 

方法一： 

     8. 加入 20ul 2X SDS-sample buffer 重悬 HA tag-Nanobody-Agarose Beads。在 95℃条件下加热 10 min，把免疫沉淀复合物从珠子上游离出来，然后在 4 ℃，2,500 g 条件下离心 3 分钟收集上清，进行免疫印迹分析。 

方法二： 

     9. 替代步骤 8 的可选步骤：加入 50ul 0.2 M pH2.5 的甘氨酸洗脱结合的蛋白，建议孵育时间 30 秒，并不断混匀，随后离心，转移上清液到新管中，为了中和酸性的甘氨酸，需添加 5ul 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：为了提高洗脱效率可以重复这一步。

方法三： 

     10. 替代步骤 8 或 9 的可选步骤：也可以加入过量的 HA tag 的多肽进行洗脱。 

产品效果：