Phos-tag™ Acrylamide

SDS-PAGE 分离不同磷酸化水平的蛋白！

　　在不使用放射性同位素的情况下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分离不同条带中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分离后的凝胶可用于 Western blotting 和质谱分析等后续实验。

　　Phos-tag™ SDS-PAGE 操作简单，只需在常规 SDS-PAGE 胶中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn²⁺ 或者 Zn²⁺ 即可进行实验。在电泳过程中，磷酸化蛋白的磷酸基团与 Phos-tag™ 中的二价金属离子相结合，降低其迁移速度，从而可区分磷酸化与非磷酸化蛋白。

◆原理

◆优点、特色

●  采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可轻松分离磷酸化蛋白

　  无任何放射性元素及化学标记！

●  可检测不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

　  无需任何磷酸化抗体！

●  适用于内源性蛋白的磷酸化分析！

◆案例、应用

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比较】

我推荐使用Phos-tag ™ ——东京大学研究院医学研究科 小川觉之

　　Phos-tag ™ 是专为研究磷酸化蛋白而新开发出来的试剂。此产品使用方便，不但可用于体外实验，还能定量分析体内蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常规电泳实验，无需购买特殊设备，性价比高。传统蛋白磷酸化的研究需要特异的磷酸化抗体、RI 等其它试剂，操作复杂，花费大，且放射性元素会有安全隐患，而 Phos-tag ™ 的出现恰恰可以弥补这些缺点，为磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分离效果图

　　Lane 1 为非磷酸化蛋白，Lane 2-5 为磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化状态不同而条带迁移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的数量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的丰度等都可根据条带迁移和条带浓度求得。

【资料提供】

日本东京大学研究生院医学系研究科

【二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体】

　　小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K 。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

二维电泳

　　同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

　　横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化学研究所 RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的变化】

　　常规 SDS-PAGE 和Phos-tag^TM SDS-PAGE 后迚行克疫印迹实验分析 EGF 刺激的 A431 细胞中 MAPK 磷酸化水平。

摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

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