百瑞极——免疫学基础实验--ELISA(1)

ELISA的历史

ELISA的发展起点要追溯到RIA（radioimmunoassay）的历史，Yalow和Berson在1960s第一次使用碘标记的RIA技术来测定内源血浆中的胰岛素水平，然而放射性实验安全风险太高，不适合进行大面积推广应用，这时候一些科学家便想用生物酶来代替放射性标记，但如何将酶与抗体或抗原连接而不影响彼此的生物活性成为了必须要捅破的窗户纸，尽管在当时被普遍认为是不可能的实验，Perlmann和Schuurs 还是在1966年力证了酶连接的免疫试验是可行的，直到1971年，Perlmann和Schuurs两个研究组几乎同时发表了ELISA的文献，向世人系统性的介绍了ELISA的方法，此后，ELISA经历迅速的，直接开启了商业临床和医疗诊断的应用。

ELISA的实验原理

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。

由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔（当然就是我们熟知的96孔板啦）中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。

ELISA的类型

目前酶联免疫吸附测定使用的最多的是检测特异性的抗体或可溶性的抗原，因被检测的物质可分为多类，且每次的结构与特征都不相同，所以为了提高灵敏度开发了不同类型的ELISA方法，主要分为四种：

（1）直接ELISA

这是Perlmann最早建立的ELISA方法，通常用于检测分子量比较大的抗体或抗原，以及抗体筛选和抗原表位作图，这个模式比较简单，将抗原包裹在孔中，加入酶连接的特异性抗体，靶向固定化的抗原，成为牢固的复合体，洗去结合不紧密的抗体或背景蛋白后，加入合适的底物量，孵育使其发生特定的酶反应催化，产生显色反应，通过检测荧光信号来定量分析物。

Direct ELISA

Direct ELISA方法优缺点比较

（2）间接ELISA

由于受到direct ELISA方法的鼓舞，Lindström和Wager在1978年发表了indirect ELISA方法，之所以叫indirect ELISA方法，是因为相对于direct ELISA，它引入了第二个抗体来进行检测，与direct ELISA不一样的是，它通过使用一抗能结合多个二抗，从而放大了检测灵敏度，就好像在一个黑暗的房间，direct ELISA只有一个50W的灯泡，而indirect ELISA能接上两个50W的灯泡，这样房间的亮度是不一样的。

Indirect ELISA

Indirect ELISA方法优缺点比较

（3）夹心法ELISA

这项ELISA技术是最受欢迎的，1977年，Kato和他的同事发明了这项结合direct与indirect ELISA 技术特点的经典方法，“sandwich”最明显的特点就是特异性高，灵敏度高，试想去分辨身高长相完全一致的双胞胎，你只熟悉并想找到其中一个人，然而单靠肉眼已经无法做出最正确的判断了，这时候需要听他们各自的声音便来区分。Sandwich ELISA将一抗固定在孔表面，含目标抗原的测试样被加入到孔中使其充分结合抗体，待洗去未结合的杂质后，加入酶标记二抗结合抗原的另一表位，形成“sandwich”的结构，这时候的抗原就像被两个面包片夹着的奶油，通过酶催化发生显色反应就可以测定抗原的含量。