近年来，细胞外囊泡（EV）相关的研究正加速发展。2011年每年有约200篇相关论文发布，但2016年一年间有1000篇以上的相关论文发布，论文内容涉及各种生理功能和病理症状等方面。EV大致可分为核内体来源的外泌体和细胞质膜来源的微囊泡，但即便是用提取纯度最高的超速离心法也难以将二者完全分离，所以简单地将10,000×g离心后上清中的EV称为小EV（主要是外泌体）^1）。外泌体是由各种细胞分泌的小型膜囊泡（直径30~100nm），存在于大多数体液（如血液、尿液、髓液等）和细胞培养液中。外泌体是由脂质双层膜包被的膜囊泡，产生于称为多囊泡体的细胞外囊泡中，多囊泡体通过与细胞膜融合将外泌体释放到细胞外。外泌体含核内体来源的蛋白质（如ESCRTs）、细胞内运输相关蛋白（如RabGTPase等）及细胞膜来源蛋白（如CD63, CD81等）等各种内分泌细胞来源的蛋白和RNA，同时还含有分泌细胞膜来源和内体膜来源的脂质（如胆固醇和鞘磷脂等）^2）。多年来，外泌体被认为参与无用的细胞内含物质的释放。但是近年来，外泌体在活体内作为运载脂质、蛋白质、RNA等细胞间信息传递的新型媒介而倍受瞩目。随着其功能在生理及病理功能的阐明，外泌体在临床应用的相关研究中，特别是诊断治疗、生物标记的开发也迅速发展起来。

　　现在，外泌体研究几乎涉及所有的研究领域（免疫、神经系统、癌症、内分泌、循环系统等）。例如，免疫细胞来源的外泌体含有抗原肽/MHC复合体和可能控制着免疫细胞间抗原信息的交换、免疫细胞活化/非活化等各种免疫应答机制的各种抗原^3）。外泌体在神经系统中与神经回路的控制相关^4），同时各种神经退行性疾病的致病蛋白还可以通过外泌体释放到细胞外并传递到其他细胞，与病情发展密切相关^5）。 癌细胞释放的外泌体含有许多与血管新生和免疫逃逸相关的分子，构建适合癌细胞生长的微环境，促进癌细胞的发展^6）。另外，癌细胞来源的外泌体上粘着分子的表达形式决定着癌症向器官的转移途径^7）。最近，有报告指出脂肪细胞释放的外泌体对肝脏的遗传基因表达有控制作用^8）。许多病毒利用外泌体的产生路径感染细胞，受病毒感染的细菌和寄生虫通过外泌体控制其他受细胞感染的细菌、寄生虫的活动^9、10）。

　　上述这些功能几乎都是通过细胞分泌到外泌体中的分子引起的。其中已发现外泌体内含有分泌细胞来源mRNA和miRNA，外泌体与细胞间遗传基因表达信息的水平传播相关性倍受瞩目^11）。这些RNA被外泌体的脂质双层膜所保护，不会被核糖核酸酶所分解，可以在血液和体液中稳定存在。被靶细胞吞噬的外泌体通过与内体膜融合，将RNA释放到靶细胞的细胞质中。释放出来的mRNA翻译为蛋白质，但miRNA抑制目的基因的翻译，因此外泌体在靶细胞内控制基因的表达。外泌体的蛋白质有数万种，mRNA、miRNA的种类有数千种以上，它们的结构除了受细胞来源不同的影响，还受到细胞状态不同的影响。另外，外泌体中这些物质的结构与它们在分泌细胞内的结构不同，所以可能存在一种外泌体特异蛋白和mRNA/miRNA在外泌体内选择性积累的机制。这种特异性可将外泌体内的RNA作为生物标记，更进一步作为治疗开发方法的靶点。外泌体中的mRNA一旦被靶细胞吞噬，能够引起这个细胞内的功能性蛋白的表达，但外泌体中多数的miRNA是前体而非功能性miRNA，这些miRNA起着何种生理性意义，学者们正在研究。由于外泌体含有各种蛋白质、RNA和脂质，研究人员正将其进行细胞分类，建立数据库（ExoCarta）。此外，在世界各地分别进行着运用蛋白质组学、转录组学和系统生物学的大规模分析工作，而FunRich的EV plugin作为一种通用的分析手段已被公布出来。今后，在推进外泌体研究方面，各领域的研究人员信息共享至关重要。

 ◆运用外泌体进行治疗和诊断的功能开发

　　随着外泌体的功能逐渐被发现，近年来，应用这些功能的治疗法也在被开发出来。例如，血液中的成纤维细胞所释放的外泌体，可以促进角质形成细胞的移动和增殖以及血管新生来促进伤口愈合。有报导指出，外泌体内miRNA参与促进血管新生、抗炎症性和促进胶原蛋白沉淀等一系列过程^12）。从癌症患者树突状细胞释放的外泌体中，含有各种癌症细胞来源的蛋白质，可以强化杀伤性T细胞对癌症细胞的特异性反应。利用此功能的抗肿瘤免疫疗法，目前正处于初期临床研究阶段^13）。另外，科学家也尝试利用外泌体的抑制发病机制功能。例如，类风湿关节炎患者的滑膜成纤维细胞所释放的外泌体，高浓度集聚诱导细胞死亡的TNF-α，可使类风湿关节炎恶化^14）。通过上述介绍可以知道癌症细胞来源的外泌体含有与癌症进展相关的分子，神经细胞来源的外泌体含有与神经退行性疾病相关的分子，因此，通过抑制或去除这些外泌体，有希望抑制疾病发生。随着今后的研究发展，外泌体功能逐步清晰，并扩大临床应用，有望将外泌体应用在各种疾病治疗上。甚至可尝试利用外泌体将siRNA和抗癌药剂等运输到目标细胞中。各种细胞粘着分子在外泌体膜表面表达，由其决定外泌体被运输往哪一种细胞，期望开发利用该特征的新型DDS^15）。外泌体在体液中十分稳定，同时外囊泡所含的蛋白质和RNA被外泌体的脂质双层膜所包被也不会分解。另外在从体液中提取外泌体后，体液可长期稳定保存，因此外泌体有望成为临床检测的新型疾病生物标记。外泌体与各种疾病的相关性被检测出，特别是血液中释放的癌细胞来源的外泌体，其与正常细胞来源外泌体在结构分子上的差异倍受瞩目，并作为癌症早期诊断技术，应用于与癌症进展相关的研究^16）。甚至人们期望将尿液中的外泌体作为肾脏、前列腺疾病、膀胱疾病的新型诊断标记，髓液中的外泌体作为脑内肿瘤和神经退行性疾病的新型标记物。

 ◆外泌体研究的课题和展望

　　已经有许多关于外泌体作用的报导，根据这些现象实验中，从体液和培养上清中高纯度提取的高纯度外泌体，在活体内是否真的能发生作用尚未能确定。确认外泌体生理作用的唯一方法就是明确外泌体的释放机制，通过促进或抑制释放机制，分析会引起何种生理作用，这是进一步研究的发展方向。甚至活体内的外泌体动态（哪个外泌体迁移至何处）也会成为今后需要努力研究的重要课题。

　　目前，提取外泌体的方法主要有超速离心法、PEG沉淀法，但这些方法混有非常多的杂质，必须慎重分析得到的是否是外泌体。超速离心法存在操作繁杂、回收量不稳定，不能用于定量分析、必须使用昂贵的超速离心机、无法进行多样品分析等问题。因此外泌体研究相对困难，需要尽快开发操作简单、可提取高纯度外泌体的技术。因此，日本和光着眼于巨噬细胞的外泌体受体Tim4蛋白，制备Tim4细胞外域与磁珠结合的“Tim4磁珠”^17）。Tim4通过磷酯酰丝氨酸（PS）法特异性结合Tim4蛋白和磁珠，再经过含有EDTA的洗脱缓冲液进行分离，提取高纯度的完整外泌体。实际上，用PS亲和法提取的人白血病细胞释放的外泌体，其纯度与超离心法和PEG沉淀法提取外泌体做比较， PS亲和法提取的外泌体，其蛋白特异性检测可高出10~100倍以上，几乎没有混入外泌体以外的蛋白，回收量高，操作重复性好。结果表明，PS亲和法可以检测到许多目前为止都无法检测的外泌体蛋白质和RNA。应用Tim4的外泌体强结合能力，可用ELISA或FACS高灵敏度定性检测、定量分析外泌体。以前无法用超速离心法提取的微囊泡，也通过运用PS亲和法实现高纯度提取。本指导书中对该技术进行详细说明，这项技术的有用性今后将受到世界各方评价，有望在外泌体和微囊泡生理功能的分析研究上起重大贡献。

　　外泌体的检测和提取还遇到一个困难即：对各种外泌体的分类。研究人员尚未统一定义以何种方法提取的细胞外囊泡可以称之为外泌体，给实验数据的分析和重复性确认带来困难。近年，随着国际细胞外囊泡协会的成立、世界性研究者研讨会的举办，提案MISEV指南作为国际标准，计划或已经开始进行EV研究的科学家请务必阅读这些方针^18、19）。另外，建立记录各论文实验条件的数据库也可作为规避混乱的方法之一^20）。一方面，随着EV研究倍受世界瞩目，各国启动了大型研究项目。美国启动NIH战略性大型项目（Extracellular RNA Communication），国际权威性学会——Gordon和Keystone Symposia也从2016开始成立会议小组。受到欧洲药物研究开发公司“创新药物倡议组织（IMI）”的支持推进的CANCER-ID项目，也包含EV研究在内。2017年日本选定了EV研究为文部科学省研究开发战略的目标之一，期待会加速今后的研究发展。无论如何，今后EV研究的根本就是必须有强有力的研究方法和技术，而PS亲和法有望成为其中之一。

◆参考文献

MagCapture™ 外泌体提取试剂盒 PS Ver.2
提高回收率和纯化纯度的外泌体提取/纯化试剂盒

本试剂盒是提取/纯化外泌体的试剂盒，比起第一代产品（293-77601 MagCapture™ 外泌体提取试剂盒PS），提高了外泌体的回收率和纯度，并缩短了实验操作的时间。使用本试剂盒纯化的外泌体可以直接用于细胞摄取实验。

◆特点

●　提高了外泌体的回收率和纯度

●　缩短亲和反应的时间（3 h→1 h）

●　降低纯化外泌体的细胞毒性

◆数据

■  比较外泌体的回收率

Western blotting EV标记的比较

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在间充质干细胞（MSC）的培养上清中，使用第一代产品（图中简写为Ver.1）和本试剂盒（图中简写为Ver.2）提取和纯化含外泌体的细胞外囊泡（图中简写为EV）。然后，对所得样品进行纳米级粒子数检测以及使用PS MagCapture™ 外泌体 ELISA Kit（链霉亲和素HRP）（产品编号：298-80601）和WB比较EV标记物。

Ver.2与Ver.1相比，回收率有所提高。

■　比较纯化外泌体的细胞毒性

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使用Ver.1和Ver.2提取和纯化COLO201细胞培养上清中含外泌体的细胞外囊泡。然后仅将elution buffer或纯化外泌体加入到人正常成纤维细胞中，观察经过48 h后的细胞形态变化。

在Ver.1中，加入外泌体和elution buffer后48 h出现了细胞死亡，而Ver.2中未观察到明显的细胞毒性。证明Ver.2中elution buffer的细胞毒性已经降低了。

■　比较不同亲和反应时间里外泌体纯化的回收率

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在COLO201细胞培养上清中，为Ver.2设定4个亲和反应时间条件，提取和纯化含外泌体的细胞外囊泡（EV）。然后，获得的样品使用PS MagCapture™ 外泌体 ELISA 试剂盒（链霉亲和素HRP）（产品编号：298-80601）比较EV表面标记物。

在Ver.2中，确认了1 h的亲和反应可以充分提取到培养上清中的细胞外囊泡。

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