产品规格：50T，100T

产品内容：

储存条件：4℃避光冷藏，请勿冻存。有效期见外包装。

光谱特性 

     FITC-Annexin V: Abs/Em = 494/518 nm

     PI: Abs/Em = 535/617 nm (with DNA)

产品介绍 

     FITC-Annexin V 和 PI 凋亡试剂盒提供了一种快速简便的方法，通过标记早期凋亡细胞（绿色）和坏死细胞（红色），用于检测细胞凋亡水平。产品可以使用流式细胞仪或其它荧光检测设备进行检测。

     FITC-Annexin V 可以标记凋亡细胞。Annexin V 选择性结合磷酯酰丝氨酸(phosphatidylserine，简称 PS)。在细胞发生早期凋亡时，PS 会外翻到细胞表面，即细胞膜外侧。用绿色荧光探针 FITC 标记的 Annexin V，即 FITC-Annexin V，可以结合外翻的磷酯酰丝氨酸，从而检测细胞凋亡的重要特征。 

     碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种 DNA 结合染料，它可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞的细胞核。PI 可以由 488,532 或 546 nm 的激光激发，呈现红色荧光。

使用方法 

     下列实验方案以利用星形孢菌素诱导 Jurkat 细胞凋亡为例，如果使用其他诱导剂和其他类型的细胞，实验条件需要略作调整。

一、流式细胞检测 

1. 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处理的细胞样品，作为阴性对照。此外，设定一组样品做单染， 用于调节补偿。 

2. 收集细胞。悬浮细胞：300 g，4℃离心 5 min 收集细胞；贴壁细胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 300 g，4℃离心 5 min收集细胞，胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

     注：用胰蛋白酶消化然后使细胞在最佳细胞培养条件和培养 基中恢复约30分钟，然后再染色。 胰蛋白酶消化会暂时破 坏质膜，允许Annexin V结合磷脂酰丝氨酸在细胞膜的细胞 质表面上，从而导致假阳性染色。

3. 用预冷的PBS 洗涤细胞两次，每次均在 300 g，4℃下离 心 5 min，收集 1-5×105 个细胞并用100 μL 1×结合缓冲液 重悬细胞。 

4. 每管加入 4-5 μL 的 FITC-Annexin V 和 5 μL 的 PI工作液。 

     注：我们推荐准备两管额外的流式管，每管只加入一种单染染料（FITC-Annexin V 和PI），用于流式单染的补偿调节。

5. 室温避光孵育 10-15 min，为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作。 

6. 每管加入 400 μL 的 PBS 或 1×结合缓冲液，尽快通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。FITC-Annexin V 可以由 488nm 激光激发，检测荧光发射光谱约在 530 nm 处（FITC 通道），PI 通道发射光谱约在 617 nm 处（注：PBS 或 1×结合缓冲液的选择根据不同凋亡处理以及不同细胞具体选择）。

二、荧光显微镜检测

     对于悬浮细胞，可参照流式细胞检测的方法进行具体操作。 

1. 在盖玻片或载玻片小室中接种细胞。 

2. 根据实验要求诱导细胞凋亡。检测样品中应包含未经处 理的细胞样品，作为阴性对照。 

3. 用PBS 洗涤细胞。 注：细胞收集后如果不用 PBS 清洗，可以用含血清的培养 基直接替代Annexin V 结合缓冲液，但是 Annexin V 的使用浓度需要重新优化。 

4. 每 100 μL 的 Annexin V 结合缓冲液中加入 5-25 μL的FITC-Annexin V 和 5 μL 的PI。 

     注：最佳使用浓度由具体实验要求确定。

5. 向培养板中加入足量的染液以覆盖全部细胞，室温避光 孵育 15-30 min。为避免细胞凋亡进程，孵育过程可在冰上操作，但孵育时间至少延长至 30 min。 

6. 用 1×结合缓冲液清洗细胞。 

7. 将孵育有细胞的盖玻片置于载玻片上，载玻片可提前加一滴 1×结合缓冲液；对于培养在小室内的细胞，可直接加 入足量的 1×结合缓冲液覆盖细胞。 

8. 使用合适的滤光片在荧光显微镜下观察细胞 。FITC-Annexin V 可用 FITC 适用的滤光片，PI 可用 Cy3 或者 Texas。

注意事项： 

1. 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。 

2. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。