Phos-tag™ Acrylamide

SDS-PAGE 分离不同磷酸化水平的蛋白！

　　在不使用放射性同位素的情况下，利用 Phos-tag™ SDS-PAGE 即可分离不同条带中的磷酸化和非磷酸化蛋白。分离后的凝胶可用于 Western blotting 和质谱分析等后续实验。

　　Phos-tag™ SDS-PAGE 操作简单，只需在常规 SDS-PAGE 胶中加入 Phos-tag™ Acrylamide 和 Mn²⁺ 或者 Zn²⁺ 即可进行实验。在电泳过程中，磷酸化蛋白的磷酸基团与 Phos-tag™ 中的二价金属离子相结合，降低其迁移速度，从而可区分磷酸化与非磷酸化蛋白。

◆原理

◆优点、特色

●  采用 Phos-tag™ SDS-PAGE 可轻松分离磷酸化蛋白

　  无任何放射性元素及化学标记！

●  可检测不同磷酸化水平的磷酸化蛋白

　  无需任何磷酸化抗体！

●  适用于内源性蛋白的磷酸化分析！

◆案例、应用

【使用Phos-tag™ SDS-PAGE的磷酸化/非磷酸化蛋白比较】

我推荐使用Phos-tag ™ ——东京大学研究院医学研究科 小川觉之

　　Phos-tag ™ 是专为研究磷酸化蛋白而新开发出来的试剂。此产品使用方便，不但可用于体外实验，还能定量分析体内蛋白的磷酸化水平。Phos-tag ™ SDS-PAGE 可用于常规电泳实验，无需购买特殊设备，性价比高。传统蛋白磷酸化的研究需要特异的磷酸化抗体、RI 等其它试剂，操作复杂，花费大，且放射性元素会有安全隐患，而 Phos-tag ™ 的出现恰恰可以弥补这些缺点，为磷酸化蛋白研究提供新的方向。

磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白利用Phos-tag ™ SDS-PAGE 的分离效果图

　　Lane 1 为非磷酸化蛋白，Lane 2-5 为磷酸化蛋白，各蛋白因磷酸化状态不同而条带迁移率也有所不同。

　　磷酸化/ 非磷酸化蛋白的数量比、磷酸化程度、磷酸化蛋白的丰度等都可根据条带迁移和条带浓度求得。

【资料提供】

日本东京大学研究生院医学系研究科

【二维电泳中的应用：分析 hnRNP K 磷酸化异构体】

　　小鼠巨噬细胞 J774.1 经 LPS 刺激后，裂解细胞，经过免疫沉淀法分离得到 hnRNP K 。在二维电泳中，一维是IPG 胶，二维是 Phos-tag ™ SDS-PAGE，可分离 hnRNP K 的异构体。利用质谱仪，可以确认不同的点代表不同的亚型或修饰蛋白。

二维电泳

　　同一个等电点的位置上，不同位点发生磷酸化都可以被区分开来（例: spots 6 vs. 8 and spots 4 vs. 7）

【参考文献】

Characterization of multiple alternative forms of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K by phosphate-affinity electrophoresis. Y. Kimura, K. Nagata, N Suzuki, R. Yokoyama, Y. Yamanaka, H. Kitamura, H. Hirano, and O. Ohara, Proteomics , Nov 2010; 10(21): 3884-95.

【结果提供】

　　横滨市立大学 生命纳米系统科学研究科 生物体超分子系统科学专业 木村弥生（Dr. Y. Kimura）、平野久（Dr. H. Hirano）理化学研究所 RCAI 小原收

【EGF 刺激前后MAPK 磷酸化水平的变化】

　　常规 SDS-PAGE 和Phos-tag^TM SDS-PAGE 后迚行克疫印迹实验分析 EGF 刺激的 A431 细胞中 MAPK 磷酸化水平。

摘自 Kinoshita-Kikuta, E. et al., Mol.Cell. Proteomics. (2007)6: 356.

◆相关产品

phos-tag™ 由日本广岛大学研究生院医齿药学综合研究科医药分子功能科学研究室开发，对应指导手册请见相关资料。